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天津工生所等醇脱氢酶的结构解析和立体选择性改造研究获进展

来源:天津工业生物技术研究所 日期: 2014年06月13日

 

手性醇是一类在手性碳上连有羟基的旋光性模块化合物,以其独特的光、热和化学稳定性,是医药、农药和精细化工材料的重要手性中间体。开发手性醇中间体的研究对推动我国制药工业、材料工业以及信息电子产业的发展都具有重要的战略意义。其中,光学活性芳香醇类化合物,是合成抗抑郁、平喘、肾上腺素受体激动剂、NK1拮抗剂等药物的前体,也是制备高性能液晶和液晶器件的重要手性原料。目前,利用醇脱氢酶具有高度的化学、区域和立体选择性的特点,不对称还原潜手性羰基化合物,已成为获得手性醇的一种重要途径。因此,开展醇脱氢酶的催化机制及其理性改造的研究具有重要的理论价值和实践意义。

中国科学院天津工业生物技术研究所郭瑞庭研究员的研究组与江南大学生物工程学院徐岩教授研究组合作,解析了来源于Candida parapsilosis的(R)-羰基还原酶(RCR)与辅酶NAD+、底物2-羟基苯乙酮及产物(R)-苯基乙二醇的三种复合体的晶体结构,阐明了RCR与辅酶结合、底物识别和产物释放的Prelog立体选择性的分子催化机制。然而,自然界中绝大多数醇脱氢酶都是催化辅酶的pro-R氢进攻底物羰基的re面生成相应的手性醇,遵循Prelog规则,只有极少数醇脱氢酶具有反Prelog选择性。因此,通过理性改造获得反Prelog立体选择性醇脱氢酶无疑是对氧化还原手性生物催化体系适用性的有力加强和重要补充。

RCR属于中链醇脱氢酶家族成员。结合RCR与已报道的具有立体选择性的中链醇脱氢酶的晶体结构及其氨基酸序列的比对,发现形成RCR的底物结合口袋的氨基酸残基中,具有大侧链的F285和W286分别位于小底物结合口袋的入口处和内部,并且相对于其它成员不保守。在此两个关键位点设计突变,构建突变体F285A、W286A、F285A/W286A。功能检测发现,对所检测的8种芳香酮类底物,3个突变体的立体选择性发生了不同程度的变化。其中,双突变F285A/W286A对8种底物的选择性都发生了反转,特别是底物-溴代-4-氯苯乙酮的识别从re面变成si面,对映选择性完全反转达到>99.9% e.e.。通过模拟对接分析,进一步解释了立体选择性反转的分子基础。

该研究得到国家“973”计划、“863”计划、自然科学基金等的支持。相关研究成果发表在Chemical Communications 和Acta Crystallographica Section F 期刊上,在天津工生所客座培养的江南大学生物工程学院的博士研究生王珊珊为论文的第一作者。